Куриный эмбрион микробиология. Методы экспериментального заражения куриных эмбрионов

Цель занятия

Ознакомить студентов с методами отбора куриных эмбрионов для культивирования вирусов.

Оборудование и материалы

Куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя

Культивирование вирусов на куриных эмбрионах наиболее доступный и удобный метод для первичного выделения вируса. Практика применения этого метода заражения показала ряд преимуществ перед другими методами. Для заражения используют эмбрионы 5-12 дневной инкубации.

ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ КАК БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения вирусов от больных животных и из объектов внешней среды, так и для последующего культивирования вирусов в лаборатории. Этот метод широко применяется для идентификации вирусов и антител, а также для приготовления вакцин и диагностикумов. Практика приме­нения показала ряд преимуществ этого метода перед культивированием вирусов на лабораторных животных. Известно, что белые мыши, которых широко ис­пользуют при вирусологических исследованиях, могут быть спонтанно зараже­ны рядом вирусных инфекций: эктромелией, лимфоцитарным хориоменингитом, энцефалитом Тейлора, вирусной пневмонией, вирусом Сендай и другими, что крайне осложняет работу и нередко приводит к ошибочным выводам при оценке получаемых результатов. Культивирование вирусов на куриных эмбрио­нах в значительной мере устраняет указанные выше трудности. Наряду с этим от куриного эмбриона можно получить значительно большее количество вируса, чем от лабораторных животных. Куриный эмбрион обладает большей жизнеспо­собностью и устойчивостью к разного рода воздействиям, неизбежным при вве­дении исследуемого материала. При известном навыке работы с эмбрионами и соблюдении правил асептики гибель их незначительна. Наибольший отход эмб­рионов бывает при введении материала в амниотическую полость и желточный мешок, но и в этих случаях она не превышает 10–15 %, если соблюдены необхо­димые условия инкубирования.

Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX в. Их использование расширило спектр культивируемых в лабораторных условиях вирусов, позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи в связи с тем, что куриные эмбрионы имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными: 1)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней среды; 2) важным преимуществом эмбрионов является также их высокая чувствительность к широкому спектру вирусов, что объясняется недостаточным развитием защитных механизмов; 3) куриные эмбрионы легкодоступный объект в связи с развитием широкой сети птицефабрик и инкубаториев; 4) куриные эмбрионы экономичны, не требуют ухода и кормления.

Основными недостатками являются: 1) невозможность полностью гарантировать стерильность этой живой системы, так как эмбрионы могут нести в своем содержимом вирусы и другие патогенные агенты (вирусы инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, гриппа, лейкоза, хламидии и микоплазмы). Их присутствие может искажать результаты исследования; 2) куриные эмбрионы чувствительны не ко всем вирусам.

ЦЕЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

Используют куриные эмбрионы в вирусологии в основном для тех же целей, что и лабораторных животных, а именно:

– обнаружения в патматериале активного вируса биопробой;

– первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;

– поддержания вирусов в лаборатории;

– титрования вирусов;

– накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин;

– как тест-объект в реакции нейтрализации.

ТРЕБОВАНИЯ К КУРИНЫМ ЭМБРИОНАМ

Яйца необходимо получать из благополучных по вирусным болезням хозяйств. В оплодотворенных яйцах даже от клинически здоровых кур могут находиться различные встречающиеся у этих птиц вирусы: ньюкаслской болезни, инфек­ционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, энцефаломиелита, парагриппа-2, полиартрита, оспы, арбовирусы, аденовирусы и др. Присутствие этих вирусов может, с одной стороны, привести к диагностическим ошибкам, а с другой, на основе явления интерференции, – к подавлению размножения виру­са, находящегося в исследуемой пробе. Эмбрионы, не содержащие вируса, но полученные от кур, бессимптомно за­раженных определенными вирусами, также могут быть менее чувствительны или абсолютно нечувствительны к действию данного вируса благодаря наличию специ­фических антител, полученных от матери с желтком. Для удачного выделения вируса необходимо, чтобы куры, эмбрионы которых используют в работе, не были вакцинированы против болезни, возбудителя ко­торой ищут. Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Для обеспечения нормального развития зародышей в оплодотворенных яй­цах в период инкубации необходимо соблюдать определенную температуру и влажность. Развивающиеся эмбрионы переносят перегрев значительно хуже, чем охлаждение. Поэтому кратковременная (в течение нескольких часов) поломка в системе обогрева не приносит большого вреда. При более длительном перерыве необходим подогрев.

Инкубируемые яйца нуждаются в свободном доступе свежего воздуха, кото­рый поступает через отдушины. Они должны быть всегда открытыми. Одно яйцо, как принято считать, расходует 1 л кислорода в день, что неудивительно, если вспомнить о бурном развитии зародыша в течение 21 дня инкубации. Именно поэтому яйца нельзя класть вплотную, а также одно на другое. Для инкубации яиц непригодны обычные термостаты. Лишь в случае крайней необходимости их можно использовать для этих целей, но при этом часто проветривать ипоста­вить внутрь сосуд с водой для обеспечения требуемой влажности.

Заложенные на инкубацию яйца через 3–5 дней просвечивают с помощью специальной настольной или ручной (если яйца не вынимают из лотка инкуба­тора) лампы, чтобы отобрать неоплодотворенные. Наиболее удобны для вирусо­логических работ яйца леггорнов, так как их тонкая белая скорлупа позволяет лучше рассмотреть содержимое. Неоплодотворенные или содержащие погибших зародышей яйца из инкубатора удаляют. Доля оплодотворенных яиц колеблется в значительных пределах в зависимости от многих факторов, в том числе от времени года: весной она самая высокая, зимой самая низкая.

Второй раз зародыши просвечивают в день запланированного заражения. Срок этот зависит от вида вируса, а также пути его введения. На скорлупе обычным (не чернильным) карандашом отмечают место заражения.

СТРОЕНИЕ КУРИНОГО ЭМБРИОНА

Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша (рис. 15). В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами.

Рисунок 15 - Схематический разрез куриного эмбриона на 8-й день инкубации: 1 – скорлупа; 2 – подскорлупная оболочка; 3 – хорионаллантоисная оболочка; 4 – аллантоисная полость; 5 – желточный мешок; 6 – белок; 7 – воздушная камера; 8 – тело зародыша; 9 – амниотическая полость

Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твердой пористой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Последняя в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в околоплодную жидкость, заполняющую амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток также располагается эксцентрично и относительно зародыша как бы по другую сторону продольной оси.

Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится аллантоисная полость, покрывающая амнион и желточный мешок, а к 10-11-му дню замыкающаяся в остром конце яйца. В процессе развития аллантоисная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка.

Заражение в ту или другую часть эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назначением и определяет оптимальный для заражения возраст эмбриона.

Так, желточный мешок как резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем (после 12-го дня) по мере развития зародыша он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-й день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл.

Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-й день развития эмбриона, поэтому заражение в аллантоисную полость проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.

Хорионаллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13-й день. Заражение на хорионаллантоисную оболочку проводят на 10-12-й день инкубации.

ПОДГОТОВКА КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ К ЗАРАЖЕНИЮ

Эмбрионы доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37 °С и влажности 60-70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляционные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Рекомендуется до момента заражения дать возможность эмбрионам в течение суток адаптироваться к новым условиям и нормализовать свои функции после транспортного стресса. Если лаборатория располагает собственным инкубаторием, то снесенные курицей оплодотворенные яйца пригодны для закладки в него в течение 10 дней.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур (рис. 16). Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб. Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считают живыми.

Рисунок 16 - Овоскопирование куриного эмбриона на 10-е сутки инкубации. Видны тени: 1 – зародыша; 2 – желточного мешка; 3 – кровеносных сосудов ХАО; 4 – воздушной камеры; 5 – белка

Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют – обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона.

Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3–4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором.

В работе используют инструменты, стерилизованные кипячением. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием.

Демонстрация

а) клинических признаков заболевания у зараженных лабораторных животных; б) методов умерщвления лабораторных животных; в) техники вскрытия (обращают внимание студентов на состояние внутренних органов) и приемов получения вируссодержащего материала; г) техники изготовления отпечатков мозга; д) действий по обеззараживанию рабочего места и трупа после вскрытия зараженного животного.

Задания

1.Изучить строение куриного эмбриона.

2.Провести овоскопию куриного эмбриона, определить его жизнеспособность и отметить границы теней естественных образований.

3. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.

Самостоятельная работа студентов

а) распознавание по цветной метке зараженных каждым из студентов мышей, анализ их клинического состояния, умерщвление, фиксация в кювете с восковым (парафиновым) дном, вскрытие; б) анализ патологоанатомических изменений, получение вируссодержащего материала (паренхиматозных органов), приготовление послойных отпечатков мозга.

Студенты проводят овоскопию куриного эмбриона, определяют его жизнеспособность и отмечают границы теней естественных образований.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1. Строение куриного эмбриона.

2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?

3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?

Куриные эмбрионы -- очень дешевая и удобная система культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной степени размножаются почти все штаммы вирусов как человеческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают в эмбрионах достаточно высокие титры, или 10--10 БОЕ на 1 эмбрион). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и поэтому для размножения в нем вируса не нужно создавать специальные стерильные условия.

Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца, откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-каллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость; при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно.

Вирус лучше всего размножается в 10--12-дневных эмбрионах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инкубировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обязательно иметь специальное оборудование, однако инкубатор очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °С, если их регулярно переворачивать. Сортность яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно исключить возможность заражения яйца другими микроорганизмами; некоторые поставщики продают специальные незараженные яйца.

Перед заражением следует убедиться в том, что яйца действительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате. Через 4--5 дней после оплодотворения эмбрион должен быть ясно виден.

При стандартном пассировании лабораторных штаммов вирусный инокулят обычно представляет собой образец инфицированной аллантоисной или культуральной жидкости. Как правило, образцы перед использованием разводят солевым раствором Хэнкса до концентрации вируса 10--10 БОЕ/мл, поскольку введение в яйцо большого количества вируса способствует образованию ДИЧ. Если перед заражением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор для разведения следует ввести желатин. Естественно, необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуляту добавляют антибиотик гентамицин.

Данные методы предполагают использование гомогенизации для измельчения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их осветления и введение неразведенного супернатанта в амниотическую полость.

Заражение эмбрионов.

I. Введение вируса в аллантоисную полость

• 1. Яйца кладут на бок и протирают сверху спиртом для стерилизации участка вокруг точки заражения.
• 2. В скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью зубоврачебного сверла, снабженного режущим диском. Отверстие должно быть достаточно глубоким, чтобы в него можно было ввести иглу для инъекций, но желательно не повреждать внутреннюю мембрану скорлупы.
• 3. С помощью шприца с иглой № 25 в аллантоисную полость инокулируют 0,1 мл вируса, вводя при этом иглу непосредственно под скорлупу.
• 4. Отверстие в скорлупе запечатывают небольшим количеством расплавленного воска.
• 5. Зараженные яйца инкубируют в термостате во влажной атмосфере острым концом вниз. Во время инкубации нет необходимости переворачивать яйца.

II. Введение вируса в амниотическую полость

• 1. Тупой конец яйца стерилизуют, протирая спиртом, и проделывают небольшое отверстие, как показано на схеме.
• 2. Яйцо располагают вблизи яркого источника света в темной комнате так, чтобы был виден эмбрион.
• 3. Иглу № 23 длиной 4 см вводят в проделанное отверстие, а затем резким движением в направлении эмбриона -- в амниотическую полость. При этом вносят 0,1 мл вируса и осторожно извлекают иглу.
• 4. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным воском и инкубируют яйца, как указано выше.

Время инкубации.

Оптимальное время инкубации, необходимое для получения максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма и должно быть определено экспериментально. Для некоторых штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, максимальный выход достигается через 24--26 ч, в то же время большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также вирусы типов В и С требуют 48--72 ч инкубации.

Сбор вируса.

Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4--18 ч при 4°С или в течение 30 мин при --20 °С. При охлаждении эмбрион погибает, а окружающие его кровеносные сосуды сужаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, которые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя материал 30 мин при 37 °С. В этих условиях вирионная нейраминидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связывается вирус, и он освобождается.

I. Сбор аллантоисной жидкости

• 1. Яйца помещают на подставку тупым концом вверх и стерилизуют их поверхность спиртом.
• 2. Тупой конец яйца вскрывают, пользуясь при этом либо стерильным пинцетом, либо специальным приспособлением. Скорлупу вокруг воздушного мешка удаляют, открывая доступ к аллантоисной полости.
• 3. С помощью стерильного пинцета с тупыми концами разрывают хорионаллантоисную мембрану и отодвигают ее к краю яйца.
• 4. Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пинцетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широким концом. Из яйца среднего размера получают 7--10 мл бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жидкости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее отборе следует избегать повреждения желточного мешка. Если вирус предназначен для биохимических исследований, например для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную жидкость следует собирать при 0 °С.
• 5. Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием 10 мин при 10 000 g и хранят супернатант при 4 или --70 °С.

II. Сбор амниотической жидкости

• 1. Поверхность яйца стерилизуют и вскрывают тупой конец, как описано выше. Удаляют возможно большую часть^ скорлупы, чтобы легко было извлечь содержимое яйца.
• 2. Хорионаллантоисную мембрану разрывают и выливают содержимое яйца в стерильную чашку Петри. При этом амнио-тическая полость должна остаться неповрежденной.
• 3. С помощью шприца с иглой № 25 из амниотической полости по возможности более полно извлекают содержимое.
• 4. Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же, как и аллантоисную жидкость.

Ожидаемый выход.

Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры, но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000--5000, а иногда и до 20 000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят.

С тех пор как обнаружили, что вирусы гриппа размножаются в куриных эмбрионах, этот метод стал широко применяться в вирусологии, так как прост в применении и не является дорогим.

Используют 7-9 дневные куриные эмбрионы (полный цикл развития 21 день).

Перед заражением поверхность обрабатывают спиртом, раствором йода, в скорлупе делают отверстие и заражают стерильным шприцем.

Способы заражения: в амниотическую полость, в аллантоисную полость или в желточный мешок. Вирусы размножаются на соответствующих оболочках, накапливаются в полостной жидкости, которую затем и можно собрать для дальнейшего исследования.

Эмбрионы культивируют при 37 град. 3 суток, затем снова обрабатывают скорлупу, вскрывают стерильными инструментами эмбрион и собирают вируссодержащую жидкость. Все работы по заражению и вскрытию производят в боксе.

Культивирование на культурах клеток.

Культуры клеток стали применять в вирусологии в последние десятилетия, это дало возможность культивировать и изучать гораздо более широкий спектр вирусов, так как не все человеческие вирусы возможно выделить на животных или на эмбрионах. Таким образом, современная вирусология пользуется клеточными культурами, которых получено в настоящее время огромное множество.

Разновидности клеточных культур

а) первичные - получают из эмбриональной ткани, путем ее измельчения, обработки трипсином для дезагрегации (разъединения) клеток и дальнейшего культивирования

in vitroв специальной культуральной жидкости.

б) перевиваемые – получают из опухолевой ткани, они отличаются тем, что их можно культивировать неограниченно долго, меняя только культуральную среду и посуду.

В процессе культвирования на стекле получается монослой: то есть один слой клеток.

Теперь можно заразить эти клетки исследуемым материалом с предполагаемым вирусом, либо уже имеющимися вирусами. Посуду с клетками, зараженными и незараженными, культивируют в термостате при 37 градусах.

Процесс накопления вирионов в клеточной культуре длится примерно 48 – 72 часа.

Подбирая подходящие культуры, можно культивировать практически все человеческие вирусы.

Следующая стадия изучения – индикация и идентификация вирусов.

Методы индикации.

Индикация – это обнаружение вирусов непосредственно в исследуемом материале или в культуральной жидкости или в зараженных клетках.

I.Если вирионы находятся в жидкости, то обнаружить их можно с помощью реакции гемагглютинации.

Суть реакции: некоторые виды вирусов способны спонтанно склеивать (то есть вызывать гемагглютинацию) каких – либо эритроцитов. Например, вирионы гриппа склеивают эритроциты кур, некоторые аденовирусы – эритроциты крысы и т.д.

Таким образом, с помощью взвеси эритроцитов в физиологическом растворе можно обнаружить вирусы в вируссодержащей жидкости.

II. Если вирусы размножаются в клеточной культуре, но являются гемагглютинирующими, то можно обнаружить их с помощью реакции гемадсорбции: на культуру наносят взвесь эритроцитов, инкубируют, сливают – если культура заражена, то эритроциты прилипнут прямо к зараженным клеткам – это видно в световой микроскоп.

III.Другие эффекты:

а) вирусы вызывают разрушение монослоя – это называется цитопатогенное действие вируса - ЦПД.

б) вирусы вызывают морфологические изменения клеток: внутриклеточные или внутриядерные включения, образование синцития, симпластов (то есть слияние нескольких клеток в одно образование из-за повреждения клеточных мембран).

Эмбрионы используют в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения. Размножение в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша.Способы заражения: на хорионаллантоисную оболочку, в аллотоисную и амниотическую, желточный мешок, тело эмбриона.

29.Тканевые культуры.

В зависимости от техники приготовления 3 вида клеток:

Однослойные способны размножаться на поверхности химически нейтрального стекла в виде монослоя;

Суспензионные, размн-я во всем объеме питательной среды;

Органные-цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру.

Приготовление первичной культуры клеток складываются из нескольких этапов: измельчение ткани, разъединение клеток, отмывание полученной суспензии от трипсина.

Индикация:

- цитопатичекое действие- видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до отторжения от стекла.

Вирусные включения- это скопление вирусных частиц или отделение компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток.

Бляшки-ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток. Они видны как светлые пятна на фоне окрашенных клеток.

Цветная проба

Гемадсорбция-способность культур клеток адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Интерференция.

30.Классификация, хим.Состав бактериофагов.

Бактериофаги- вирусы бактерий, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, вызывать их растворение. Имеют форму головастика, некоторые кубической нитевидной формы. Состоят из икосаэдрической головки и хвостого отростка. Внутри хвостого отростка цилиндрический стержень,снаружи- чехол, отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белка. У фагов имеющих форму сперматозойда, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки входят в состав оболочки. Кроме структурных белков обнаружены внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой и белки-ферменты, участвующие во взаимодействии фага с клеткой.

31. Процесс взаимодействия вирулентных фагов и чувствительной к ним бактериальной клетки

Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки.

Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц.

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста (чаще всего 9-12 дневные , иногда 5-12 дневные).

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом или спиртом.

Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хориоаллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок, тело зародыша. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Существует два способа заражения куриных эмбрионов:

1) открытый – скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, при помощи острых ножниц срезают скорлупу, снимают верхний листок оболочки воздушного мешка и проводят заражение. Отверстие закрывают специальной стеклянной крышкой или скорлупой и герметизируют стерильным растопленным парафином.

2)Закрытый - скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, делают колющим инструментом отверстие в скорлупе и вводят при помощи шприца с толстой иглой 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала под контролем овоскопа. Отверстие закрывают стерильным расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 2-4 суток. Затем их охлаждают до 4ºС на протяжении суток для максимального сужения сосудов. Вскрывают в стерильных условиях, предварительно обработав скорлупу спиртом или йодом.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.

Культивировать вирусы возможно только в живых клетках. Для этого используют любую биологическую систему: животные организмы, куриные эмбрионы, культуры клеток. При выборе лабораторных животных необходимо выполнять следующие требования: - животные должны быть здоровы. Вновь поступивших в виварий содержат в карантине (мышей и крыс 14 дней, остальных - 21 день). Для исключения латентных (скрытых) инфекций вирусной этиологии.

Для всех животных выполняются требования: - животные должны быть чувствительными к данному вирусу; - возраст животного имеет большое значение: наиболее чувствительны молодые и новорожденные, но в некоторых случаях для выявления ярких клинических признаков болезни используют взрослых животных; - животные должны быть одного возраста и массы тела; лучше для этого подходят линейные животные, т.е. полученные в результате близкородственного скрещивания.

При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.